電轉染法將綠色熒光蛋白基因植入小鼠肌肉

摘要：本研究旨在將細胞電通透技術應用于DNA肌肉轉染，通過優化電場強度、脈沖時值和質粒劑量等參數，實現高效電轉染。實驗采用增強綠色熒光蛋白（EGFP）基因質粒作為報告基因，注射到小鼠脛前肌后給予特定電脈沖，轉染率顯著提高。該方法為基因治療及體內基因表達研究提供了新思路和應用前景。

引言

綠色熒光蛋白（GFP）是一種來自水母的蛋白質，具有更好的熒光性質，能夠在特定波長光的激發下發出綠色熒光。近年來，GFP被廣泛應用于生物學研究中，特別是在轉基因動物研究中得到了廣泛認可。利用GFP基因的表達，科學家可以追蹤細胞、組織以及整個生物體系的運動和功能。在轉基因動物研究中，通過將GFP基因轉入目標細胞或組織中，科學家可以用熒光顯微鏡觀察其在生物中的位置和運動軌跡，繁殖情況以及基因表達水平等重要信息。

肌肉是非病毒載體基因轉染的良好場所，可以長時間表達基因產物，且在體內容易被觸及。通過骨骼肌轉染治療性基因，可用于治療進行性肌營養不良等肌肉本身疾病，還可以用于表達血管生成因子治療肢體缺血性疾病或合成疫苗等。然而，單純肌肉注射裸基因或者含有報告基因的質粒其表達水平極低，不易獲得具有顯著性的有效結果。

1998年，Mir等提出了肌肉基因電轉染的新方法，通過細胞電通透作用，可以簡單而又有效地將非病毒載體基因轉入動物肌肉，包括靈長類動物。肌肉基因電轉染成為研究的熱門領域，并有望將來被用于腫瘤、貧血等疾病的臨床治療。本研究旨在探討肌肉基因電轉染的條件，為后續利用肌肉進行抗腫瘤基因的電轉染研究奠定基礎。

材料與方法

1.1 質粒

pEGFP-C1綠色熒光蛋白質粒，由吉林大學前列腺疾病防治研究中心惠贈（以下稱為EGFP質粒）。EGFP質粒置于大腸E.coli菌JM109內擴增，堿裂解法提取、純化。瓊脂糖凝膠電泳鑒定質粒，其中超螺旋結構占70%～80%，無RNA殘留。質粒溶解于K-PBS溶液（NaCl 30.8 mmol·L?1、KCl 20.7 mmol·L?1、Na?HPO? 8.1 mmol·L?1、KH?PO? 1.46 mmol·L?1、MgCl? 10 mmol·L?1溶解于雙蒸水）中，定量，調節質粒濃度為1 g·L?1。

1.2 動物

昆明系小白鼠購于吉林大學實驗動物中心，共160只，4～6周齡，體重18～20 g，雌雄各半，隨機分組，每組8只。

1.3 電通透儀

電通透儀由方波電脈沖發生器和針式電極組成（自行研制）。方波電脈沖發生器輸出電脈沖主要指標：電場強度0～2500 V·cm?1，脈沖時值0～100 ms，脈沖次數0～15次，脈沖頻率0～10 Hz。針式電極為雙針電極，正負極間距0～1 cm，為銀制電極。

1.4 肌肉基因電轉染參數的確定

濃度為1 g·L?1質粒根據實驗需要量注射到小鼠的脛前肌，注射后給予電脈沖，針式電極間距0.6 cm、次數8次、頻率1 Hz為固定參數。1周后處死動物，取小腿脛前肌冰凍切片后熒光顯微鏡下進行觀察。

1.4.1 電場強度和脈沖時值的確定

EGFP質粒DNA 15 μg，注入30 s后給予電脈沖。按電場強度和脈沖時值共分為8組，即20和50 ms組分別給予電場強度0、100、200和400 V·cm?1。觀察不同電場強度和脈沖時值對轉染率的影響。其中，0 V·cm?1的20和50 ms組相當于單純質粒肌肉注射實驗。

1.4.2 注入質粒劑量的確定

電場強度200 V·cm?1、脈沖時值20 ms，注入30 s后給予電脈沖。按質粒DNA注入的量分為3組，即7.5、15和30 μg組。

1.4.3 注入質粒后給予電脈沖的時間間隔的確定

質粒DNA 15 μg，電場強度200 V·cm?1、脈沖時值20 ms。按注入后給予電脈沖的時間間隔分為2組，即注入質粒30 s后給予電脈沖（electric pulse, EP）組和注入質粒1 h后給予EP組。

1.4.4 轉染后DNA表達最佳時間的確定

質粒DNA 15 μg，電場強度200 V·cm?1、脈沖時值20 ms，注入30 s后給予電脈沖。按轉染后處死動物進行觀察的時間不同分為7組，即按處死動物的不同時間分為轉染后第1、3、7、14、21、28和35 d組。

1.5 轉染陽性肌纖維的確定

所取的骨骼肌標本先迅速置于液氮中冰凍，然后保存在-80℃冰箱中。取轉染區骨骼肌做冰凍切片，厚度為100 μm，熒光顯微鏡下觀察到陽性轉染的肌纖維發出綠色熒光。發現陽性轉染細胞后，切片厚度改為12 μm，熒光顯微鏡下觀察結果，與光鏡下對比后計數，按以下公式計算轉染率。

結果

EGFP質粒15 μg注射到小鼠的脛前肌，在注入后給予如下參數，即電脈沖200 V·cm?1，20 ms，1 Hz，8次，轉染率最高，可達（73.2±7.2）%。EGFP質粒注射后不會在細胞外立即降解，注射質粒DNA 1 h內給予電脈沖不影響轉染率；15 μg為適當的DNA劑量；EGFP蛋白的表達，7 d達到高峰。

討論

2.1 電轉染法優化參數的確定

本研究通過一系列實驗，確定了肌肉基因電轉染的最佳參數條件。實驗結果表明，當EGFP質粒劑量為15 μg，電場強度為200 V·cm?1，脈沖時值為20 ms，脈沖頻率為1 Hz，脈沖次數為8次時，轉染率最高，可達（73.2±7.2）%。這一結果為后續實驗提供了重要的參考依據。

2.2 電轉染法提高轉染率的機制

與單純EGFP質粒肌肉注射相比，DNA肌肉電轉染可極大地提高其轉染率。這一結果可能與細胞電通透作用有關。細胞電通透是一種利用短暫的高壓電脈沖改變細胞膜通透性的技術，可使細胞膜形成微小孔洞，允許外源DNA進入細胞內。本研究通過優化電脈沖參數，實現了高效、安全的DNA肌肉轉染。

2.3 電轉染法在基因治療中的應用前景

肌肉是非病毒載體基因轉染的良好場所，可以長時間表達基因產物，且在體內容易被觸及。通過骨骼肌轉染治療性基因，可用于治療進行性肌營養不良等肌肉本身疾病，還可以用于表達血管生成因子治療肢體缺血性疾病或合成疫苗等。本研究為肌肉基因電轉染提供了優化參數，為基因治療及體內基因表達研究提供了新思路和應用前景。

2.4 研究的創新點

本研究創新性地將細胞電通透技術應用于DNA肌肉轉染，并通過優化電場強度、脈沖時值和質粒劑量等參數，實現了高效電轉染。此外，本研究還通過一系列實驗驗證了電轉染法的安全性和可行性，為基因治療及體內基因表達研究提供了新思路和應用前景。

結論

本研究將細胞電通透技術應用于DNA肌肉轉染，通過優化電場強度、脈沖時值和質粒劑量等參數，實現了高效電轉染。實驗結果表明，當EGFP質粒劑量為15 μg，電場強度為200 V·cm?1，脈沖時值為20 ms，脈沖頻率為1 Hz，脈沖次數為8次時，轉染率最高，可達（73.2±7.2）%。與單純EGFP質粒肌肉注射相比，DNA肌肉電轉染可極大地提高其轉染率。本研究為肌肉基因電轉染提供了優化參數，為基因治療及體內基因表達研究提供了新思路和應用前景。