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誠信經營質量保障價格合理服務完善本研究旨在探討外源性端粒酶基因（hTERT）轉染對豬氣管上皮細胞（STECs）增殖特性的影響。通過脂質體法將重組質粒pCI-neo-hTERT導入STECs，轉染后的細胞表現出增高的增殖活性，并保持基本的細胞生物學特征，為建立穩定傳代的細胞系提供了可能。
哺乳動物的氣管黏膜上皮細胞（Trachea epithelium cells, TECs）不僅是多種病原體的靶細胞，也是阻擋病原入侵的重要屏障。豬氣管上皮細胞（Swine trachea epithelium cells, STECs）作為研究豬呼吸道疾病發病機制的重要模型，其體外培養技術的建立具有重要意義。然而，原代培養的STECs存在壽命短暫的局限性，限制了其廣泛應用。端粒酶是一種能夠維持端粒長度的核糖核蛋白復合物，通過激活端粒酶，可以延長細胞在體外培養的壽命，從而實現細胞的永生化。本研究通過轉染外源性端粒酶基因（hTERT）至STECs，探討其對細胞增殖特性的影響，旨在為建立永生化的豬氣管上皮細胞系奠定基礎。
細胞：初生仔豬氣管黏膜上皮細胞（STECs）
質粒：重組質粒pCI-neo-hTERT
試劑：某品牌鏈酶蛋白酶、某品牌脂質體轉染試劑、某品牌G418抗生素、某品牌RNA提取試劑、某品牌PCR擴增試劑、某品牌Western blot試劑
儀器：倒置顯微鏡、某品牌PCR儀、某品牌電泳儀、某品牌Western blot成像系統、威尼德電穿孔儀
STECs的分離與培養：無菌采取初生仔豬氣管，采用鏈酶蛋白酶灌注冷消化法分離得到原代STECs。分離后的細胞在37℃、5% CO2條件下培養，并觀察細胞形態。
細胞鑒定：采用間接免疫熒光法鑒定8型角蛋白的上皮源性，確認分離得到的細胞為豬氣管上皮細胞。
基因轉染：以脂質體法將重組質粒pCI-neo-hTERT導入STECs。脂質體與質粒的體積比為1:3，轉染48小時后加G418進行抗性篩選1個月，得到抗G418的陽性克隆，繼續擴大培養。
基因表達檢測：采用PCR和Western blot法檢測轉染后STECs中hTERT基因的表達情況。
細胞增殖活性檢測：用MTT法和流式細胞儀分別檢測轉染細胞的活力和增殖周期。
通過倒置顯微鏡觀察，轉染后的STECs形態正常，細胞呈單層貼壁，多邊形鋪路石狀生長。PCR擴增得到大小為461 bp的hTERT基因片段，Western blot檢測得到大小為125 ku的特異性條帶，表明hTERT基因在轉染細胞中成功表達。
細胞活力曲線顯示，轉染后的STECs在接種后的第3～5天增殖速度最快。流式細胞儀檢測結果顯示，轉染細胞的細胞核型為2倍體，S期細胞比例達到48.35%，說明轉染后的細胞具有較高的增殖活性。
經過長期培養，轉染hTERT基因的STECs成功建立了永生化的細胞系，可傳代至55代以上，且保持了原代細胞的形態及功能特性。永生化細胞系具有正常的細胞增殖周期，比原代細胞生長更為活躍。
端粒是影響細胞永生化機制的重要因素之一。端粒長度決定了細胞的增殖能力和壽命，足夠長的端粒長度能在染色體末端形成環狀結構，提供保護。當端粒縮短到一定程度時，細胞將逐漸失去增殖能力，導致衰老和死亡。通過激活端粒酶，可以延長染色體末端DNA，確保端粒足夠的長度，從而延長細胞在體外培養的壽命。本研究通過轉染hTERT基因，成功激活了STECs的端粒酶活性，實現了細胞的永生化。
永生化細胞系具有長期培養、增殖活性高、遺傳性狀穩定等優點，是研究疾病發病機制、藥物篩選和疫苗開發的重要工具。本研究建立的永生化的STECs不僅保持了原代細胞的形態及功能特性，還具有更高的端粒酶活性和增殖活性。該細胞系可用于豬呼吸道病原體的感染研究，為揭示豬呼吸道疾病的發病機制提供新的細胞模型。
本研究采用脂質體法將重組質粒pCI-neo-hTERT導入STECs，通過優化轉染條件，提高了轉染效率。同時，通過嚴格的抗性篩選和純化步驟，成功建立了永生化的細胞系。該細胞系的建立不僅為豬呼吸道疾病的研究提供了新的細胞模型，也為其他動物細胞永生化的研究提供了借鑒。
方法創新：本研究采用脂質體法將hTERT基因轉染至STECs，成功實現了細胞的永生化，為豬呼吸道上皮細胞的長期培養提供了新方法。
模型創新：建立的永生化的STECs保持了原代細胞的形態及功能特性，具有更高的增殖活性，為豬呼吸道病原體的感染研究提供了新的細胞模型。
疾病研究：永生化的STECs可用于豬呼吸道病原體的感染研究，揭示病原體的致病機制和宿主的防御機制。
藥物篩選：該細胞系可用于藥物篩選，評估藥物對豬呼吸道病原體的抑制作用和細胞毒性。
疫苗開發：永生化的STECs可作為疫苗開發的細胞基質，用于生產高效、安全的疫苗。
