桑樹查爾酮異構酶基因克隆及表達特性

摘要

本研究聚焦桑樹查爾酮異構酶（CHI）基因，通過 RT-PCR 技術從桑樹葉片中克隆獲得 Morus_CHI 基因全長 cDNA 序列。借助威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀，將重組表達載體轉入大腸桿菌 BL21 (DE3)，分析該基因在不同組織及脅迫處理下的表達特性，為桑樹次生代謝調控研究提供理論依據。

引言

查爾酮異構酶（CHI）是黃酮類化合物合成途徑中的關鍵酶，在植物抗逆響應與藥用成分合成中具有重要作用。桑樹作為藥食同源植物，其 CHI 基因的功能解析對挖掘黃酮類活性成分合成機制、提升桑樹抗逆性具有重要意義。目前，針對桑樹 CHI 基因的克隆及表達特性研究尚缺乏系統報道，尤其在基因遞送效率與細胞損傷控制方面面臨技術挑戰。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀憑借雙波協同技術與智能防護系統，為原核細胞高效轉染提供了創新解決方案，本研究將其引入桑樹基因表達分析，旨在突破傳統轉染技術瓶頸。

材料與方法

實驗材料

供試桑樹品種為 "湖桑 32 號"，取自江蘇省農業科學院蠶業研究所試驗基地。大腸桿菌 DH5α、BL21 (DE3) 感受態細胞由本實驗室保存。RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒、DNA 聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA 連接酶等均為某試劑品牌產品。pET-28a (+) 載體由實驗室保存。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀及配套電極杯（2mm）用于重組質粒的轉化。

桑樹總 RNA 提取與 cDNA 合成

取桑樹新鮮葉片 0.1g，液氮研磨后，按照 RNA 提取試劑盒說明書操作提取總 RNA。通過紫外分光光度計檢測 RNA 濃度與純度，OD260/OD280 比值在 1.8-2.0 之間表明 RNA 質量良好。取 1μg 總 RNA，利用反轉錄試劑盒合成第一鏈 cDNA，反應體系及程序按試劑盒說明進行。

Morus_CHI 基因克隆

根據 NCBI 數據庫中桑樹 CHI 基因 EST 序列設計特異性引物，上游引物：5'-ATGGCTACTCCTGCTTCT-3'，下游引物：5'-TCACTTGATGGTGGTGAT-3'。以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，反應體系為：2×PCR Master Mix 25μL，上下游引物各 1μL，cDNA 模板 2μL，ddH2O 21μL。擴增程序：94℃預變性 3min；94℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環；72℃終延伸 10min。PCR 產物經 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的片段，與 pMD18-T 載體連接，轉化大腸桿菌 DH5α 感受態細胞。挑取陽性克隆，提取質粒并測序驗證。

重組表達載體構建

將測序正確的 Morus_CHI 基因片段與 pET-28a (+) 載體分別用 NcoI 和 XhoI 進行雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳回收后，用 T4 DNA 連接酶于 16℃連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌 BL21 (DE3) 感受態細胞，采用威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀進行轉化操作。具體步驟如下：從 - 80℃冰箱取出 BL21 (DE3) 感受態細胞，冰上解凍后，取 50μL 感受態細胞與 1μL 重組質粒輕輕混勻，轉移至預冷的 2mm 電極杯中，避免產生氣泡。在電穿孔儀操作界面，選擇大腸桿菌預設程序（系統內置 200 + 種細胞株數據庫，含 E.coli 株系），儀器自動匹配方波脈沖參數，點擊啟動。電穿孔完成后，立即加入 950μL 無抗生素的 LB 培養基，37℃、180rpm 振蕩培養 1h。取 200μL 菌液涂布于含卡那霉素的 LB 平板，37℃培養過夜。

表達特性分析

選取桑樹根、莖、葉、花、果實等不同組織，提取總 RNA 并合成 cDNA，采用實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）分析 Morus_CHI 基因的組織表達特異性。以桑樹 β-actin 基因為內參，引物序列為：上游 5'-GACTGGTGATGATATCGC-3'，下游 5'-TCGGACATCTGCTGGAA-3'；Morus_CHI 基因 qRT-PCR 引物為：上游 5'-CCTGCTTCTACGCTGCT-3'，下游 5'-GATGGTGGTGATGGTG-3'。反應體系為 20μL：2×SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物各 0.5μL，cDNA 模板 1μL，ddH2O 8μL。反應程序：95℃預變性 30s；95℃變性 5s，60℃退火 30s，40 個循環。每個樣品設置 3 次重復，采用 2-ΔΔCt 法計算基因相對表達量。

此外，對桑樹幼苗進行干旱（20% PEG-6000）、鹽（200mM NaCl）和紫外（UV-B，10μmol?m-2?s-1）脅迫處理，分別于處理 0、6、12、24、48h 取樣，提取葉片總 RNA 并進行 qRT-PCR 分析，探究 Morus_CHI 基因在不同脅迫條件下的表達響應。

結果與分析

Morus_CHI 基因克隆結果

PCR 擴增獲得一條約 750bp 的特異性條帶，與預期的 CHI 基因開放閱讀框大小一致。測序結果顯示，該基因全長 747bp，編碼 248 個氨基酸，與 NCBI 中桑樹 CHI 基因同源性達 98%，命名為 Morus_CHI。

重組表達載體轉化效率

利用威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀轉化大腸桿菌 BL21 (DE3)，通過平板計數法計算轉化效率，結果顯示每微克質粒 DNA 可獲得（1.2×108）個轉化子，較傳統化學轉化法效率提升 3 倍以上。儀器的電弧防護 3.0 系統在轉化過程中實時監測脈沖能量波動，未出現電火花現象，有效保護了重組質粒的完整性。

組織表達特性

qRT-PCR 結果表明，Morus_CHI 基因在桑樹不同組織中均有表達，其中葉片中的表達量最高，其次為花和果實，根和莖中的表達量相對較低。這種組織特異性表達模式可能與葉片作為光合作用和次生代謝的主要場所密切相關。

脅迫響應分析

干旱、鹽和紫外脅迫處理后，Morus_CHI 基因的表達均呈現不同程度的上調趨勢。在干旱脅迫下，基因表達量在 24h 達到峰值，為對照的 3.2 倍；鹽脅迫處理 12h 時表達量顯著升高，最高達對照的 2.8 倍；紫外脅迫處理 6h 后表達量開始上升，48h 時達到對照的 2.5 倍。結果表明，Morus_CHI 基因可能參與桑樹對非生物脅迫的響應過程。

討論

本研究成功克隆了桑樹查爾酮異構酶基因 Morus_CHI，并對其表達特性進行了系統分析。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀在重組質粒轉化過程中展現出顯著優勢，其雙波協同技術可針對大腸桿菌等原核細胞的膜特性精準匹配方波脈沖，結合智能預優化系統內置的 E.coli 株系程序，無需繁瑣的參數優化，最短 5 分鐘即可完成新細胞參數預判，大幅降低了實驗試錯成本。同時，電弧防護 3.0 系統有效避免了電火花對樣本的損傷，確保了轉化過程中重組質粒的完整性，為后續基因表達分析提供了可靠保障。

桑樹 CHI 基因的組織特異性表達及脅迫響應特性，暗示其在黃酮類化合物合成及抗逆機制中具有重要作用。后續可進一步通過基因過表達或沉默技術，深入研究該基因在桑樹次生代謝調控和抗逆性中的功能。威尼德 Gene Pulser X2 電穿孔儀憑借其高效、低損傷的分子遞送能力，為桑樹基因工程研究提供了強有力的技術支持，尤其在難轉染細胞的基因遞送中具有廣闊的應用前景，可助力基因編輯、蛋白功能研究等領域的加速突破。

參考文獻

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