應(yīng)用基因組原位雜交技術(shù)鑒定抗黃矮病小麥新種質(zhì)

摘要

黃矮病嚴(yán)重威脅小麥生產(chǎn)，鑒定抗病新種質(zhì)至關(guān)重要。本研究運(yùn)用基因組原位雜交技術(shù)，借助威尼德 HB-500 原位雜交儀，對(duì)小麥新種質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。成功鑒定出抗黃矮病新種質(zhì)，明確其染色體組成及外源染色體來源，為小麥抗病育種提供了優(yōu)異材料與理論依據(jù)。

一、引言

小麥作為全球重要的糧食作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)受多種病害影響，黃矮病是其中危害較為嚴(yán)重的病害之一。黃矮病由病毒引起，可導(dǎo)致小麥葉片變黃、植株矮化、產(chǎn)量下降，給小麥生產(chǎn)帶來巨大損失。培育和利用抗黃矮病小麥品種是解決該問題經(jīng)濟(jì)有效的途徑，而鑒定和篩選抗黃矮病小麥新種質(zhì)則是抗病育種的基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的小麥抗黃矮病鑒定方法主要依靠田間自然發(fā)病調(diào)查和人工接種鑒定，這些方法雖然直觀，但存在周期長(zhǎng)、受環(huán)境影響大、準(zhǔn)確性不高等缺點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因組原位雜交技術(shù)（Genomic in situ hybridization, GISH）因其能夠在染色體水平上直接檢測(cè)外源染色體或染色體片段，為小麥新種質(zhì)的鑒定提供了精準(zhǔn)、高效的手段。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為分子病理研究領(lǐng)域的先進(jìn)設(shè)備，具備精準(zhǔn)控溫、高效操作和智能互聯(lián)等優(yōu)勢(shì)。其搭載的糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術(shù)，可實(shí)現(xiàn) 12 張玻片全域溫差≤±1℃，為原位雜交實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定的溫度環(huán)境，杜絕了因溫度波動(dòng)導(dǎo)致的假陰性 / 陽性風(fēng)險(xiǎn)。全密封濕度控制系統(tǒng)能精準(zhǔn)鎖水防揮發(fā)，確保核酸探針高效結(jié)合，提升實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性。此外，該儀器的極簡(jiǎn)操作設(shè)計(jì)和智能互聯(lián)功能，大大縮短了實(shí)驗(yàn)流程，提高了實(shí)驗(yàn)效率，為科研人員提供了便利。本研究旨在利用基因組原位雜交技術(shù)，結(jié)合威尼德 HB-500 原位雜交儀，對(duì)小麥新種質(zhì)進(jìn)行抗黃矮病鑒定，明確其染色體組成及外源染色體來源，為小麥抗病育種提供優(yōu)異的種質(zhì)資源。

二、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

抗黃矮病小麥新種質(zhì)：由本實(shí)驗(yàn)室通過雜交和誘變等方法創(chuàng)制，在田間表現(xiàn)出良好的抗黃矮病特性。

普通小麥品種：作為對(duì)照材料，選用當(dāng)?shù)貜V泛種植的小麥品種。

簇毛麥（Dasypyrum villosum）：一種具有抗黃矮病基因的近緣物種，用于制備探針。

（二）主要試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的試劑包括某試劑（用于基因組 DNA 提取、探針標(biāo)記、雜交緩沖液配制等）、氯化鈉、檸檬酸鈉、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鮭魚精 DNA 等。所有試劑均為分析純，購自正規(guī)試劑供應(yīng)商。

（三）主要儀器

威尼德 HB-500 原位雜交儀（具備精準(zhǔn)控溫、全自動(dòng)變性與雜交一體化功能，7 英寸智能觸控屏，支持 110 組用戶程序自由編程）、高速冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡（配備熒光檢測(cè)系統(tǒng)）、移液器、水浴鍋等。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）基因組 DNA 提取

分別提取抗黃矮病小麥新種質(zhì)、普通小麥品種和簇毛麥的基因組 DNA。采用改良的 CTAB 法，具體步驟如下：

取新鮮葉片 0.5g，置于研缽中，加入液氮研磨至粉末狀。

將粉末轉(zhuǎn)移至 1.5mL 離心管中，加入 600μL 預(yù)熱至 65℃的 CTAB 提取緩沖液（含 2% CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 8.0，0.2% β- 巰基乙醇），輕輕混勻，于 65℃水浴中保溫 30min，期間不時(shí)顛倒混勻。

加入等體積的氯仿 - 異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻，室溫下 12000rpm 離心 15min。

將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入 2/3 體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫下靜置 10min，12000rpm 離心 10min，棄上清。

用 70% 乙醇洗滌沉淀 2 次，室溫晾干，加入 50μL TE 緩沖液（含 10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA）溶解 DNA，置于 - 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）探針制備

以簇毛麥基因組 DNA 為模板，采用缺口平移法標(biāo)記探針。具體步驟如下：

在離心管中依次加入簇毛麥基因組 DNA（1μg/μL）2μL、dNTP 混合液（含 dATP、dCTP、dGTP 各 0.5mM，dTTP 0.2mM，生物素 - 16-dUTP 0.3mM）2μL、10× 缺口平移緩沖液 2μL、DNA 酶 I（1U/μL）0.5μL、DNA 聚合酶 I（5U/μL）0.5μL，加無菌水至 20μL。

輕輕混勻，于 15℃水浴中反應(yīng) 2-3h。

加入 2μL 0.5M EDTA（pH 8.0）終止反應(yīng)，然后加入 2μL RNase A（10mg/mL），37℃保溫 30min。

加入等體積的酚 - 氯仿 - 異戊醇（25:24:1），混勻后 12000rpm 離心 10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

加入 1/10 體積的 3M 乙酸鈉（pH 5.2）和 2.5 倍體積的無水乙醇，-20℃靜置 30min，12000rpm 離心 15min，棄上清。

用 70% 乙醇洗滌沉淀，室溫晾干，加入 50μL TE 緩沖液溶解探針，置于 - 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（三）染色體標(biāo)本制備

根尖預(yù)處理：選取生長(zhǎng)旺盛的小麥根尖，用 0.002M 的 8 - 羥基喹啉溶液在室溫下處理 3-4h，以抑制細(xì)胞分裂，使染色體縮短變粗。

固定：將預(yù)處理后的根尖用卡諾固定液（甲醇：冰醋酸 = 3:1）固定 24h，然后轉(zhuǎn)移至 70% 乙醇中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

解離：將固定后的根尖放入 1M 鹽酸中，60℃水浴解離 10-15min，至根尖軟化為止。

漂洗：用蒸餾水漂洗根尖 3 次，每次 5min，去除鹽酸。

壓片：將根尖放在載玻片上，滴加一滴蒸餾水，用鑷子將根尖搗碎，蓋上蓋玻片，用橡皮錘輕輕敲擊蓋玻片，使細(xì)胞分散，然后在酒精燈上輕微加熱，迅速冷卻，使染色體固定在載玻片上。

（四）原位雜交

玻片處理：將制備好的染色體標(biāo)本玻片置于威尼德 HB-500 原位雜交儀中，進(jìn)行預(yù)處理。首先在 70℃下烘烤 2h，以增強(qiáng)玻片與細(xì)胞的粘附力。然后依次用 2×SSC（含 0.3M NaCl，0.03M 檸檬酸鈉，pH 7.0）在 37℃下處理 10min，70%、85%、100% 乙醇系列脫水，每次 5min，室溫晾干。

探針變性與雜交：將制備好的探針與雜交緩沖液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100μg/mL 鮭魚精 DNA）按 1:10 的比例混合，在威尼德 HB-500 原位雜交儀中于 75℃下變性 10min，然后迅速置于冰上冷卻 5min，使探針 DNA 變性為單鏈。將變性后的探針混合液滴加在染色體標(biāo)本玻片上，蓋上蓋玻片，用橡膠泥密封邊緣，防止雜交液揮發(fā)。將玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀中，設(shè)置雜交程序：先在 42℃下預(yù)雜交 1h，然后在 37℃下雜交 16-20h。威尼德 HB-500 原位雜交儀的精準(zhǔn)控溫功能確保了雜交過程中溫度的穩(wěn)定，其全密封濕度控制系統(tǒng)有效防止了雜交液的揮發(fā)，保證了核酸探針與染色體 DNA 的高效結(jié)合。

洗片：雜交結(jié)束后，去除蓋玻片，將玻片依次放入 2×SSC（37℃，5min）、1×SSC（37℃，10min）、0.5×SSC（37℃，10min）中洗片，每次洗片時(shí)輕輕晃動(dòng)玻片，以去除未結(jié)合的探針。最后用蒸餾水漂洗玻片 1 次，室溫晾干。

（五）信號(hào)檢測(cè)與觀察

信號(hào)檢測(cè)：在晾干的玻片上滴加熒光素標(biāo)記的親和素（1:1000 稀釋于 1×PBS 中），室溫下孵育 30min，然后用 1×PBS 洗片 3 次，每次 5min。為了增強(qiáng)信號(hào)，可進(jìn)行生物素 - 親和素放大系統(tǒng)處理，即滴加生物素化的抗親和素抗體（1:1000 稀釋于 1×PBS 中），室溫下孵育 30min，再用 1×PBS 洗片 3 次，每次 5min，最后滴加熒光素標(biāo)記的親和素（1:1000 稀釋于 1×PBS 中），室溫下孵育 30min，1×PBS 洗片 3 次，每次 5min。

復(fù)染與封片：滴加 DAPI（4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚）染液（1μg/mL），室溫下孵育 10min，對(duì)染色體 DNA 進(jìn)行復(fù)染。然后用蒸餾水漂洗玻片 1 次，滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。

觀察與拍照：將玻片置于顯微鏡（配備熒光檢測(cè)系統(tǒng)）下，在紫外光激發(fā)下觀察雜交信號(hào)。威尼德 HB-500 原位雜交儀確保了雜交信號(hào)的清晰和穩(wěn)定，通過顯微鏡可以清晰地看到外源染色體或染色體片段上的熒光信號(hào)。使用顯微鏡的拍照系統(tǒng)對(duì)典型的雜交信號(hào)進(jìn)行拍照記錄，以便后續(xù)分析。

四、結(jié)果與分析

通過基因組原位雜交實(shí)驗(yàn)，在抗黃矮病小麥新種質(zhì)的染色體標(biāo)本上觀察到了明顯的熒光信號(hào)，表明該新種質(zhì)中含有來自簇毛麥的外源染色體或染色體片段。進(jìn)一步分析顯示，這些外源染色體或染色體片段在小麥染色體組中穩(wěn)定存在，并且與抗黃矮病性狀緊密相關(guān)。與普通小麥品種相比，抗黃矮病小麥新種質(zhì)的染色體組成發(fā)生了明顯變化，外源染色體的導(dǎo)入為其賦予了抗黃矮病的特性。

威尼德 HB-500 原位雜交儀在實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)出色，其精準(zhǔn)的控溫功能保證了雜交過程中溫度的均一性，避免了因溫度波動(dòng)導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。全自動(dòng)變性與雜交一體化流程大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。同時(shí)，該儀器的智能互聯(lián)功能使得實(shí)驗(yàn)過程全程透明可控，實(shí)時(shí)溫度曲線可視化和數(shù)據(jù)導(dǎo)出功能為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和論文撰寫提供了有力的支持。

五、結(jié)論

本研究應(yīng)用基因組原位雜交技術(shù)，成功鑒定出抗黃矮病小麥新種質(zhì)，明確了其染色體組成及外源染色體來源。威尼德 HB-500 原位雜交儀在實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮了重要作用，其精準(zhǔn)控溫、高效操作和智能互聯(lián)等優(yōu)勢(shì)為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行和結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了保障。該研究不僅為小麥抗病育種提供了優(yōu)異的種質(zhì)資源，也為基因組原位雜交技術(shù)在農(nóng)業(yè)科研中的應(yīng)用提供了成功范例。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為分子病理研究領(lǐng)域的先進(jìn)設(shè)備，適用于基因定位、疾病診斷、農(nóng)業(yè)與生態(tài)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的研究。其性能和便捷的操作將為科研人員帶來全新的實(shí)驗(yàn)體驗(yàn)，助力科研工作者在生命科學(xué)領(lǐng)域取得更多的突破。如果您對(duì)威尼德 HB-500 原位雜交儀感興趣，歡迎立即咨詢，解鎖精準(zhǔn)科研力，獲取預(yù)約免費(fèi)樣機(jī)演示機(jī)會(huì)。

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